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​发光活性测定快速评估二维和三维乳腺癌模型系统的药物反应

来自:junmin    更新日期:2022/10/8    点击量: 2775


背景介绍

多年来,在平面培养板上生长的单层细胞模型(2D 模型)一直是研究疾病机制和评估潜在新药疗效的便捷系统,2D 生长的癌细胞系长久以来则是癌症模型的实验替代品。但近年来,癌细胞以及其他细胞类型,以三维(3D)格式培养能够形成多层结构,成为疾病研究的新模型。而这些模型在生物学上更具相关性。


虽然通常需要成像和高内涵分析来获得候选药物对复杂 3D 细胞模型影响的详细信息,但同时也需要直接的基于细胞的分析以评估单个参数,如整体细胞活力。三磷酸腺苷 ATP 检测是一种广泛使用的评估治疗手段对细胞活性影响的方法在这个方法中,代谢活跃的细胞利用 ATP 作为能量来源;当营养物质受损或耗尽时,细胞会出现细胞质 ATP 的快速下降,用于测量 ATP 的分析方法通常是读取基于荧光素酶反应的发光读数。这个方法需要活细胞提供 ATP(图 1 ),并且由于细胞和试剂中缺乏背景发光,反应非常灵敏。ATP 检测的快速读数可用于快速筛选一大组化合物,并识别显著影响细胞活性的子集。然后,这个简化的集合可以应用于更集中的后续研究,包括提供更多表型细节的通量实验。


图一:荧光素酶反应用于测量细胞活力。细胞被溶解并加入荧光素酶反应,在那里它们提供产生发光所需的 ATP ,活细胞越多,产生的光信号就越多。


在这里,我们介绍一项小规模研究,是使用CellTiter Glo 3D 细胞活性分析试剂盒(Promega)测量的 2D 和 3D 细胞样本的细胞活性。我们分析了以下两种细胞类型的 2D 和 3D 细胞样本的活性,并用几种先前测试过的化合物进行了测试:MCF-7,一种常用的雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR)阳性的乳腺癌细胞系;以及 TU-BcX-4IC,患者来源的肿瘤外植体,来作为三阴性(ER、PR 和 HER2 阴性)亚型化生性乳腺癌的代表模型。使用 SpectraMax iD5 微孔板读板器进行检测,该读板器具有超冷型 PMT ,可实现低背景发光和高灵敏度。所有数据均使用 SoftMax Pro 软件进行分析,包括曲线拟合和 IC50 计算。


实验材料

  • CellTiter-Glo 3D 细胞活性分析试剂盒 (Promega cat. #G9682)

  • MCF7 乳腺癌细胞系(ATCC cat. #HTB-22)

  • TU-BcX-4IC 患者来源的原发性三阴性乳腺癌细胞(由杜兰大学 M.Burow 实验室慷慨提供)

  • MCF7 细胞系培养基:MEM(Corning cat. #10-010-CV) + 10% 胎牛血清(FBS, Avantor Seradigm cat. #1500-500)+ 1% Antibiotic-Antimycotic (Gibco 15240-062) + 0.01% mg/mL 人重组胰岛素(Gibco cat. #12585-014)

  • TU-BcX-4IC 细胞系培养基:DMEM (Corning cat. #15-017-CV) + 10% 胎牛血清(FBS, Avantor Seradigm cat. #1500-500) + 1% Antibiotic-Antimycotic(Gibco cat. #15240-062)+ 1% NEAA(Gibco cat. #11140-050)+ 0.01% mg/mL 人重组胰岛素(Gibco cat. #12585-014)

  • 384 孔 PrimeSurface 3D 白色培养板,超低附着,U 底微孔板(Sbio cat. #MS-9384WZ)

  • 384 孔白板,组织培养处理,固体底部微孔板(Thermo Fisher Scientific cat. #164610)

  • 测试化合物:硼替佐米(Tocris cat. #7282) /伊布替尼(Tocris cat. #6813) / 盐酸阿柔比星(Selleck Chemicals cat. #S1228) /帕诺比诺斯(Selleck Chemicals cat. #S1030)/ 罗咪酯肽(R&D Systems cat. #3515) /曲美替尼(Selleck Chemicals cat. #S2673)

  • SpectraMax iD5 多功能微孔板读板机(Molecular Devices)


实验方法

  • 细胞制备

3D 球体:MCF7 或 TU-BcX-4IC 细胞以每孔 2500 个细胞的量加入 384 孔 U 底微孔板,以 1000 rpm 离心平板 1 分钟聚集细胞,然后将培养板在 37°C、5%CO2 下培养 72 小时。

2D 单层培养:以每孔 5000 个细胞将 MCF7 接种到 384 孔平底微孔板中,然后在 37°C、5%CO2 下培养板 24 小时,TU-BcX-4IC 细胞以每孔 2500 个细胞进行培养,然后培养 48 小时。

  • 化合物处理

以 2D 和 3D 培养的 TU-BcX-4IC 和 MCF7 细胞在四个重复的微孔中处理,以 1:5 梯度稀释 romidepsin 为 50 nM 至 0.006 nM。细胞与化合物在 37°C 、 5%CO2 下培养 72 小时。两种培养形式的 TU-Bcx-4IC 细胞也用硼替佐米、ibrutinib、盐酸依达比星、帕诺比诺和曲美替尼处理。细胞与化合物在 37°C、5%CO2 下培养 72 小时。


孵育后,将 CellTiter Glo 3D 试剂添加到样本孔中。对于 3D 球体,摇动平板 5 分钟,然后在室温下培养 30 分钟,以便在读数前进行细胞裂解。对于 2D 培养,将平板摇晃 2 分钟,然后在室温下培养 10 分钟,然后读取荧光值。使用表 1 所示的发光检测模式和设置,在 SpectraMax iD5 读板器上读取数值。所有数据分析和绘图均使用 SoftMax Pro 软件完成。


实验结果

每组处理细胞的样本结果均使用 SoftMax Pro Software 中的 4 参数拟合,其中每条曲线的 C 参数被视为 IC50 值。在用 Romidepsin 处理的 MCF7 细胞中,3D 培养细胞的 IC50 浓度略高于单层培养细胞(图2)。与 2D 细胞相比,经 Romidepsin 处理的 TU-BcX-4IC 在 3D 培养细胞中的 IC50 稍低(图 2E)。对于其他测试的化合物,3D 培养细胞的 IC50 值通常更高,3D 和 2D 培养结果之间的差异通常约为两到三倍(图 3 ,表 2 )。


经 Romidepsin 处理的 TU-BxC-4IC 和 MCF7 细胞之间存在明显差异。在 2D 培养中,两种细胞类型的 IC50 值相似,分别为 1.13 nM 和 1.88 nM。然而,在 3D 培养中,TU-BxC-4IC 细胞的 IC50 值为 0.443 nM,比 MCF7 细胞的 5.28 nM 低 12 倍,这表明 TU-BcX-4IC 细胞培养方法对这些细胞的反应的影响比 MCF7 细胞的影响更大


表一:CellTiter Glo 3D 分析的 SpectraMax iD5 读板器软件设置。具体设置在 SoftMax Pro 软件的板部分中指定。通过选中“更多设置”下的“显示预读取优化选项”旁边的框,并遵循启动读取后出现的说明,可以优化读取高度。

图二:3D 和 2D 培养 MCF7 细胞的化合物反应。以 3D(红色)和 2D(蓝色)培养的 MCF7 细胞,用罗美肽处理。3D 和 2D 的IC50 值分别为 5.28 nM 和 1.88 nM。

图三:三维和二维培养 TU-BcX-4IC 细胞的化合物反应。红色表示三维培养的细胞,而蓝色表示二维培养的细胞。A、 romidepsin 处理的细胞;B、 硼替佐米;C、 伊布替尼;D、 依达比星;E、 变阻器;F、 特拉梅蒂尼布。

表二:药物处理细胞的 IC50 值。列出了培养为球形(3D)或单层(2D)的 MCF7 和 TU-BcX-4IC 细胞的值。所示 IC50 浓度单位为 nM 。


实验结论

使用荧光素酶在不同实验条件下读取细胞内相对 ATP 浓度发光读数的分析为快速评估细胞活力提供了一种便捷方法。细胞可以放置在 U 形底板中,在那里它们很容易形成球体;并且可以进行药物处理和 ATP 检测,而无需清洗微孔或转移球体。由此得到的细胞活性数据本身需要通过其他方法(如高内涵成像)进行进一步研究的化合物或治疗方法。


在本应用文章中,我们证明了使用 CellTiter Glo 3D 分析比较不同化合物处理两种不同细胞类型(生长为球形或单层)的活性的结果的可行性。所述的细胞培养方法和检测方法易于建立,适合中高通量筛选。SpectraMax iD5 通过 SoftMax Pro Software 自动化的数据分析和曲线拟合,提供稳健分析读数所需的灵敏度。