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先导抗体产生之噬菌体展示技术

来自:junmin    更新日期:2022/7/25    点击量: 1180

PCR技术及分子克隆技术的快速发展,促进了抗体库技术的出现和进步。PCR使人们能够使用引物扩增出全套免疫球蛋白可变区基因,分子克隆技术能够利用大肠杆菌成功表达出具有抗原结合功能的抗体分子片段,然后通过亲和筛选获得特异性抗体可变区基因,这种全套抗体基因表达文库称为抗体库,它使得抗体制备绕过杂交瘤和免疫,能够建立天然全套展示文库,并从库中容易地筛选出任一感兴趣的抗体。


抗体库技术经历了初期组合抗体库、噬菌体展示抗体库及核糖体展示抗体库三个阶段。初期组合抗体库是采用RT-PCR方法从淋巴细胞中克隆出抗体轻链和重链Fd段全套基因,并分别组建到表达载体中,感染大肠杆菌,得到轻链和重链基因库,再将轻链和重链基因随机重组到同一个表达载体中,形成组合抗体库。



















噬菌体展示技术典型流程


随后,噬菌体抗体库迅速取代了组合抗体库,它是将外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面,再通过淘洗和富集获得表达有特异肽或蛋白质的噬菌体,进而获得目的抗体的技术。它的主要流程为:


1) 构建噬菌体展示库:从B淋巴细胞中扩增抗体的基因文库,插入到噬菌体的基因组中,使抗体片段与噬菌体衣壳蛋白融合表达并展示于噬菌体表面,形成噬菌体展示抗体库。


2) 抗体库淘选:将噬菌体文库与固定抗原孵育,洗涤未结合的噬菌体,接着再洗脱与抗原特异性结合的噬菌体。此过程需要重复3-4次,以富集到高亲和力的噬菌体。在筛选过程中一般需要采用ELISA或是WB的方法进行富集验证。


丹纳赫生命科学旗下美谷分子仪器的SpectraMax i3x多功能酶标仪,可选配SpectraMax MiniMax 300细胞成像系统、Scanlater Western Blot检测卡盒,配合相应试剂以及行业领先的数据获取和分析软件SoftMax Pro,在一台仪器上即可完成ELISA和Western Blot 实验。









SpectraMax i3x多功能酶标仪


3) 噬菌体感染与筛选:将高亲和力的噬菌体感染大肠杆菌,琼脂板铺板培养挑选出克隆。


噬菌体淘选后感染大肠杆菌,进行克隆挑选,手工挑选工作量巨大且容易出错。美谷分子的QPix系列高通量微生物克隆筛选系统可进行自动加样、涂布、挑取、复制、点样、文库重排的工作,能够减轻人力负担,且拥有高达3000个克隆/小时的挑取速度,可以满足高通量挑选的的要求。













美谷分子仪器的 QPix高通量微生物克隆筛选系统


QPix配套的分析软件可以利用克隆的大小、圆度、轴比以及克隆间距进行筛选,从而更加准确高效地挑取克隆。























高亮显示选取噬菌斑   


4) 抗体验证:筛选到合适的噬菌体之后,进行测序获得正确的序列进行抗体的表达。此时,需要进行抗体的亲和力测定及功能鉴定。


贝克曼库尔特本土创新的CytoFLEX系列流式细胞仪,可进行亲和力、CDC/ADCC/ADCP的效应功能分析。如进行亲和力的检测,可采用梯度稀释的IgG孵育同等细胞数的能表达特异性抗原的阳性细胞和不能表达特异性抗原的阴性细胞,再用PE-抗 IgG抗体来检测与阳性细胞结合的IgG抗体,通过检测平均荧光强度(MFI)计算抗体与靶细胞结合的平衡解离常数(KD)来判定亲和力的强弱。

























流式检测亲和力模拟图


贝克曼库尔特的CytoFLEX系列流式细胞仪拥有高达23个参数设计,从单激光四色至六激光二十一色保证了优越的检测性能,并且符合FDA 21 CFR Part 11要求。
















贝克曼库尔特的CytoFLEX LX流式细胞仪


噬菌体展示技术拥有诸多优势,它实现了蛋白/多肽基因型与表型的统一,在蛋白质与其遗传基因之间建立了直接的物理联系;可以快速筛选得到所需抗体,通过这项技术不仅可以筛选到一般抗原的特异性抗体,也可以产生非免疫原性或毒性抗原的抗体,且所得到的抗体可以是Fab、scFv等,应用广泛。利用噬菌体展示技术生产单克隆抗体,生产快速,操作简便,效率更高,且可以进行人源化抗体的生产,具有较高的利用价值。


丹纳赫生命科学拥有多种高通量的筛选技术和多元化的鉴定表征手段,可以帮助加速度抗体的开发。