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合成生物学的构建方法——基因组装和分子克隆解决方案

来自:junmin    更新日期:2021/10/11    点击量: 678

合成生物学各个方向的研究日益活跃,对生物学领域研究的支撑作用日益突出,充分表现出合成生物学的强大创新力。


从DNA双螺旋结构的发现与遗传中心法则的阐明开始,到大规模测序技术推动下越来越多基因组遗传信息的解读,人们对生物功能与基因和基因组关系的理解逐渐深刻。丹纳赫生命科学拥有一系列的基因组装和分子克隆解决方案,可对目的基因片段的生产、纯化、定量和微生物克隆筛选等方面进行全方位的优化。


基因组装&分子克隆流程


1、寡聚核苷酸合成

依据先验知识,合成基因片段。IDT gBlocks®基因片段依托超过 30 年的业界领先制备经验合成,是作为业界标准的高保真双链基因片段,它们广泛被用于基因组装、抗体研究、CRISPR 基因组编辑以及qPCR 标准品等领域。gBlocks 基因片段可以配合许多需要以双链 DNA 作为初始材料的克隆和拼接试剂盒,可将您所需的结构序列轻松拼接到您常用的克隆系统中。与 gBlocks 基因片段兼容的克隆技术路线包括:传统克隆、Gibson组装克隆、Golden Gate克隆、TA 克隆、平末端克隆,以及所有其他已知克隆的技术路线。

2、基因片段和载体片段混合与连接
依据组装原理不同,可将DNA元件组装技术分为酶促体外组装(基于DNA聚合酶、核酸内切酶或核酸外切酶)、非酶促体外组装和体内组装(基于DNA同源重组或位点特异性重组)。Echo 声波液体处理技术可实现从 nL 到 μL 级的高精度、非接触式移液,可以帮助客户缩小基因组装反应体系,实现更快速高效的基因组装实验。

3、转化

组装好的基因被运输(转化)到感受态细胞内,Biomek自动化整合系统整合PCR仪/电转仪,震荡培养箱和离心机,可以实现高通量的热激或电激转化实验。

4、克隆点样

5、克隆筛选

自动化的克隆挑取使科学家能够专注于发现,而不是执行重复的任务。QPix 微生物克隆筛选系统使用精密的机器人技术,每小时可快速、准确地采集 3,000 个克隆。


基因片段的生产、纯化、定量


DNA的人工合成是合成生物学研究的底层推动技术。DNA化学合成法是当前主流的商业化合成方法,在合成长度和合成通量上不断取得突破,发展出柱式合成和芯片合成工艺,使寡核苷酸链合成通量可以达到百万条级,合成成本降低约3个数量级。近年来,DNA酶促合成法日益受到关注,利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)在温和的条件进行寡核苷酸链的合成,有望推动DNA合成技术的再次升级。随着DNA合成技术的快速发展,合成生物学在多个研究方向不断取得突破。IDT使用专有的合成平台生产的所有单链和双链寡核苷酸均具有行业领先的耦合效率,每种寡核苷酸均经过广泛的质量分析,包括 ESI 质谱法评估,以确保序列组成,保证从高保真寡核苷酸中生成一致、可靠的数据。


图 1. 获得的全长产品的量取决于耦合效率

寡核苷酸在专有的合成平台上合成,该平台提供高于行业标准的耦合效率。如图所示,随着寡核苷酸长度增加,耦合效率愈加重要。


微生物克隆筛选


伴随设计构建的人工基因线路的复杂度逐步提升,人工控制更加精细;组装技术取得快速进展的同时,人工基因组的设计深度也在不断拓展,设计合成的人工基因组由支原体拓展向大肠杆菌,甚至真核生物酿酒酵母,推动了生物进化演化的研究;细胞工厂的设计构建在逐步挑战代谢途径更长、复杂程度更高的化合物的合成,模块化和正交化策略对复杂细胞工厂构建的支撑作用日益明显,这就需要测试多个排列以获得所需的结果。

图2.克隆挑取效率 > 98%

A. 使用探测器自动检测琼脂厚度,高精度机械手臂准确挑取单个克隆。B. 微生物特异性挑针确保挑取到足够多的样品。C. 经过实际验证的挑针灭菌程序可以适用于各种微生物以及专业测序。D. 一个条码阅读器可以追踪样品板、微孔板和挑到的克隆。



图 3. 自动化高通量合成生物学工作流程

(基因组装、分子克隆)