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新型冠状病毒检测、疫苗及新药研发简介

来自:Marketing    更新日期:2020/3/20    点击量: 969

2020注定是不同寻常的一年,新年伊始本该是举国同庆、合家欢乐的时刻,我国却爆发了新型冠状病毒肺炎疫情。其实不仅是我国,澳洲的山火持续燃烧了四个多月,数亿动物死亡,30万只蝙蝠入侵;美国爆发40年来最致命流感,超10000人死亡,1900万人感染;东非爆发遮天蔽日的蝗灾;巴西罕见暴雨,2万人流离失所;菲律宾火山喷发,数万居民撤离;克什米尔雪崩,至少76人死亡;一代篮球巨星科比•布莱恩特坠机遇难,圈友们纷纷表示希望重启2020。

现在,我们给大家分析下现在新冠病毒是如何进行检测的,后续疫苗和新药研发进展如何?


1.新型冠状病毒肺炎现状 2019-nCoV

截至 3 月 1 日,全球累计报告新冠肺炎确诊病例 86990,其中我国报告确诊病例 79968,死亡人数超 2000。《中华流行病学杂志》17 日发表了一篇名为《新型冠状病毒肺炎流行病学特征分析》的论文。该论文指出,新冠肺炎病毒比 SARS(非典型肺炎)和 MERS(中东呼吸综合征冠状病毒)更具传染性。新冠肺炎病毒有向全球蔓延的趋势,近日意大利、日本、韩国的确诊病例数持续增加。


1.1 背景介绍

2019 年12月,武汉市出现了一系列不明原因肺炎,传染性极强。2020年1月9日,科学家在电子显微镜下,观察到引起此次不明原因肺炎的病原体呈现有包膜的、具有类似日冕外形的典型冠状病毒形态。结合基因组测序结果,证实为人类新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)。2月11日世界卫生组织将其命名为“COVID-19”(coronavirus disease 2019) 。那么到底什么是冠状病毒,为何它如此狡猾?


1.2 像“皇冠”一样的冠状病毒

冠状病毒属于冠状病毒科类病毒目(Nidovirales)的一种包膜型无节段阳性RNA病毒,广泛分布于人类和其他哺乳动物。因其形态在电镜下观察类似日冕的棘突或者是王冠而得名。

图 1. 冠状病毒。图片来源:https://www-sciencedirect-com-hk.vtrus.net/


在自然界中,冠状病毒广泛存在于动物体内,但是,它有一个明显的特点是“必须依赖宿主细胞才能繁衍”。一些冠状病毒感染后可造成人畜共患病。已知的人类冠状病毒共有七型,其中三种对我们人类的“杀伤力”巨大。这就是2019年武汉暴发的COVID-19(新型冠状病毒肺炎)、2003年首现于中国大陆随后扩散到世界29个国家和地区的SARS(严重急性呼吸系统综合征)病毒、2012年出现在沙特并扩散到27个国家的MERS(中东呼吸综合征病毒)。


1.3 病毒来源

经全基因组序列比较,2019-nCoV Wuhan-Hu-1病毒株(GenBank MN908947)与中国科学家从蝙蝠体内分离到的SARS-like CoV ZC45病毒株(2017年2月,GenBank MG772933)全基因组的一致性约89%,仅比较棘突蛋白(Spike, S)基因序列,2019-nCoV Wuhan-Hu-1病毒株(GenBank MN908947)与蝙蝠SARS-like CoV ZC45病毒株一致性约84%。据此推测,新冠病毒由蝙蝠感染到人类可能接触的动物,即经中间宿主适应演化,再感染人类。截至目前,全球科学家们还未明确此次病毒的中间宿主。



2.病毒类疾病的检测

新型冠状病毒由于具有比 SARS 和 MERS 更强的传染性,因此首先要切断传染源,防止疫情进一步扩散,同时通过各种手段尽快检测出确诊患者并隔离治疗。

病毒检测常用方法有以下几种:


2.1 基于核酸水平的检测(RT-PCR/测序)

新冠肺炎疫情爆发之后,我国科学家就快速确定了新冠病毒的全基因组序列,并于 1 月 11 日与世界卫生组织分享这一信息。我国已有 7 款新冠病毒核酸检测试剂盒获得国家药监局批准。

2 月 19 日国家卫健委办公厅下发的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》中指出,新冠肺炎疑似病例需具备以下病原学证据之一才可确诊,一是实时荧光 RT-PCR 检测新型冠状病毒核酸阳性,二是病毒基因测序后与已知的新型冠状病毒高度同源。由于二代测序检测成本问题,目前多数采用 RT-PCR 方法检测。

但在一些新闻报道中提及,RT-PCR 方法有时会出现假阴性(患者临床检测已出现“大白肺”,核酸检测却是阴性),导致疑似患者无法确诊治疗。作者推测,一方面可能是当前检测试剂盒本身的灵敏度无法检测到发病初期患者较低的病毒拷贝数,或者是检测试剂盒批次间稳定性不够;另一方面,由于疑似病例众多,各地 CDC 专业人员无法满足检测需求将检测权限下放,而一线检测人员由于没有经过系统培训,在采样、核酸提取和 qPCR 检测过程中,可能由于试剂盒操作步骤繁琐或操作不当导致一些误诊。

现在试剂盒生产公司也在优化产品质量,简化操作步骤;国家也规范了采样标准。据报道已有最快 15 分钟即可出结果的试剂盒问世,这大大缩短了新冠病毒肺炎从疑似到确诊的时间。


2.2基于蛋白水平的检测(抗原/抗体检测)

新型冠状病毒的 RNA 核心外,由蛋白质外壳包裹,表面突出的是刺突蛋白(S Protein),它是侵染宿主细胞的关键。2 月 19 日,美国得克萨斯大学奥斯汀分校(University Of Texas At Austin)和美国国家卫生研究院(National Institutes Of Health)的研究人员于《科学》(Science)杂志在线发文,他们利用冷冻电镜技术解析了刺突蛋白(Spike Protein)的分子结构,并发现它跟 SARS 病毒一样,与人体细胞表面的 ACE2(血管紧张素转化酶 2)受体作用,从而入侵细胞。它与ACE2的亲和力是 SARS 病毒的 10-20 倍,这很可能是导致高度传染性的原因。

图 2. 新冠病毒刺突蛋白结构。图片来源:Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation


新冠病毒刺突蛋白是与人体细胞结合的关键靶点,对其分子结构的解析,可以帮助研究人员顺利开展以下研究工作。第一,设计可以与刺突蛋白结合并抑制其功能的新型蛋白分子或抗体;第二,设计出这种刺突蛋白的变体,例如使其拥有更高表达水平或热稳定性,从而诱发更强的免疫反应,以加快疫苗开发;第三,展开潜在药物筛查,发现可与这种刺突蛋白结合并破坏其功能的小分子。

我国目前已有几家公司获批新冠病毒免疫学检测试剂,可为新冠肺炎疑似患者提供快速检测手段。其中有利用胶体金技术的抗体快速检测试剂,也有蛋白酶联免疫(ELISA)试剂盒。

Molecular Devices的客户——北京义翘神州科技有限公司,已自主开发成功新冠病毒 S 蛋白和 N 蛋白酶联免疫(ELISA)试剂盒,并将与合作伙伴开展临床验证工作,迅速开发出免疫学抗原快速检测试剂,用于临床样本的病毒抗原检测,解决抗体试剂窗口期漏检问题,获批后有望广泛应用于基层人群高通量筛查。微孔板读板机可以用来快速、高通量、自动化进行酶联免疫实验(ELISA)。



图 3. SpectraMax iD5 多功能微孔板读板机:一体式触屏、网端微孔板系统、操作简便、数据自动分析、数据远程自动上传


2.3 辅助检测(临床 CT 影像)

由于网络上出现了多起新冠肺炎病毒疑似患者已表现出呼吸困难,CT 提示双肺感染,但核酸检测仍为阴性故而无法确诊得到治疗的情况。2 月 3 日,武汉大学中南医院医学影像科副主任张笑春教授在微信朋友圈发文建议:“强烈推荐 CT 影像作为目前新冠肺炎首选诊断方法”,随着网络发酵,引起社会广泛关注。2 月 4 日,国家卫健委办公厅和国家中医药管理局联合印发《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》,将“疑似病例具有肺炎影像学特征者”作为湖北省临床诊断病例标准。大量以前由于核酸检测阴性无法确诊的患者被收治,同时也阻断了他们作为感染源感染其他人的可能。

以上介绍的是新冠肺炎病毒的检测方式,现在我国新冠肺炎的传播得到了有效控制,但韩国和意大利新增确诊病例成上升趋势,也有人预测新冠肺炎病毒可能转成慢性疾病,像流感一样与人类共存。无论后面疫情走势如何,终极方案都是疫苗防治和药物治疗。



3.疫苗和新药开发


3.1 疫苗开发

一般性流感疫苗大致分为以下几类:全病毒灭活苗(Whole virus vaccines)、减毒活苗(Live attenuated influenza vaccine)、亚单位疫苗(Subunit vaccines)、裂解苗(Split-virus vaccines)、核酸疫苗(Nucleotide vaccine)和重组活载体疫苗(Virus-Vector-based vaccine)。

其中全病毒灭活苗和减毒活苗都是直接将具有感染性的完整的病原微生物进行灭活或者减毒处理,保留其抗原性去除传染性,可诱发机体产生体液或细胞等免疫应答从而达到免疫的效果。而剩下的几种疫苗研发方式则都设计到对病毒或者载体核酸序列进行基因改造之后,导入新的载体细胞形成免疫蛋白或抗原,然后完成免疫应答机制。

例如最近备受关注的天津大学新冠病毒疫苗的研发方法,就是其中的亚单位疫苗,他们以新冠病毒的 S 蛋白作为靶标,通过融合表达质粒,导入酵母菌中合成蛋白,以达到启动免疫应答的目的。在这个过程中,想要验证酵母菌是否合成目标蛋白,除了进行基因测序、蛋白免疫共沉淀法来验证外,也能通过高内涵设备进行大量细胞的免疫荧光筛选方式进行验证。如下图中所展示的天津大学新冠病毒疫苗的研发流程中,在疫苗菌株筛选及酵母疫苗株筛选的过程中,均用到了免疫荧光成像法来进行,而这一步在高内涵设备上,可以实现快速的全自动高通量筛选。

除此之外,剩下的裂解苗、核酸疫苗及重组活载体疫苗过程中,均需要通过基因改造的方式进行生成具有效应的免疫载体或免疫蛋白,在构建过程以及最后的验证过程中,也同样可以通过高内涵设备来完成快速、大量的样本筛选工作,提高疫苗研发的效率。


图 4. 疫苗菌株构建及筛选方案



图 5. COVID-19 病毒 RBD-FP 域酵母疫苗菌株筛选及其口服制剂


图 6. 共聚焦型高内涵成像设备


合成目标蛋白后可以用微孔板读板机对其进行定性、定量及纯度检测。获得疫苗原液后,也需要用微孔板读板机检测前期疫苗培养、超滤、浓缩、层析等步骤中是否出现问题。

疫苗是否能产生抗体,产生的抗体是否具有免疫保护作用,需要用中和反应来检测。该方法是病毒性疾病中,不可取代的抗体检测方法。中和反应的基本方法是,将待检物质与活的病毒混合,感染细胞后,检测细胞是否发生病变,从而反应抗体阻断病毒进入细胞的能力。微孔板读板机可以检测细胞活力、细胞增殖和细胞凋亡情况。

在疫苗生产阶段为了确保疫苗有效性和批次间稳定性,需要对特异性抗体进行滴度检测,衡量抗体识别抗原决定部位所需要的最低浓度(也即最大稀释度),也就是仍能产生阳性结果的最大稀释度。通常通过 ELISA 方法来检测抗体滴度,微孔板读板机可以利用 96/384 孔板高通量完成抗体滴度检测。


图 7. SpectraMax Paradigm 多功能上转发光微孔板读板机


3.2 药物开发

众所周知,在大多数的药物开发过程的前期工作中,如果能进行大量体外细胞的毒理、药理学验证,那么将在研发的早期就能筛选掉大量不符合条件的候选化合物,从而能够为后期临床实验节省大量的研发成本。

微孔板读板机和高内涵成像设备正是在药物开发的早期实验中,发挥它巨大优势的,通过海量样本的毒理学实验,如药物的 EC50,IC50 验证等,除了可以通过微孔板读板机进行大量检测外,通过高内涵荧光成像的方式也可同步验证,还能在活细胞模组条件下,进行长时间药物反应和细胞生长的检测,获得更加动态的有效数据。


图 8. 通过长时间成像评估药物对细胞的影响


图 9. 用四参数曲线拟合绘制浓度相关响应曲线,得到相应药物的 EC50 值


同时,在本次新型冠状病毒的应对过程中,除了需要研制针对病毒的治疗手段,对肺部炎症的治疗也不可或缺。在研究抗炎药物的过程中,采用多参数细胞分析的结果,使用表型成像考察巨噬细胞形成和低体积 ELISA 分析细胞因子的分泌,能够更加全面的评估药理学化合物对炎症反应的影响。

例如,在评估抗炎化合物时,分化的人单核细胞系 THP-1 细胞被广泛用于体外巨噬细胞模型研究巨噬细胞参与的炎症反应。THP-1 细胞分化成巨噬细胞被量化测量的贴壁细胞数量使用 ImageXpress Pico 个人型高内涵成像分析系统。采用基于低体积微流控技术的 PuMA 系统 ELISA 定量测定细胞上清液中 IL-8、IL-1b 和 TNF-a 的含量。接着使用SpectraMax iD5 多功能微孔板读板机测量吸光度,计算浓度和 EC50 值。PuMA 系统运行 ELISA 小样本量( 10-20 μl,现有抗体对 )。这增强了测量上清体积有限的多个细胞因子的能力。结合成像和低体积 ELISA 提供了一个有效的多参数分析系统,可以用来测试抗炎化合物的有效性,并提供对作用机制的深入了解。



图 10. 多参数炎症分析工作流程示意图


当筛选获得备选药物后,还需对抗病毒药物进行细胞毒性实验来验证药物对人体是否有害,抗病毒药物一方面需要能够遏制病毒侵害人体,另一方面药物安全性评价也是至关重要的。微孔板读板机同样可以在药物安全性评价中发挥作用,并提供了 96、384 ,甚至 1536 孔板的高通量细胞活力检测方法,灵敏度上能和经典的[3H]胸腺嘧啶掺入法(Thymidine Incorporation Assay)相媲美。


图 11. EarlyTox Live/Dead试剂盒的检测过程


无论是疫苗研发,还是新药筛选,科研人员除了需要稳定、快速、高通量的仪器,还需要操作简单方便、能自动计算出结果,且符合GMP/GLP 要求的软件合规环境。SoftMax Pro GxP 软件,符合美国 FDA 最新的 2016 年 4 月数据完整可靠性指南分析中关于数据完整、安全、真实、有效和可追溯的要求;符合 CFDA 发布的 2018 版《药品数据管理规范》;以及欧盟制定的被称之为“史上最严的隐私条例”,于 2018 年 5 月 25 日正式生效的《通用数据保护条例》(General Data Protection Regulation)。所有用户从登陆软件开始,系统审计追踪就以飞行记录的方式,永久的、不可更改的记录所有操作流程,确保最终检测和分析结果的可靠性和真实性。当然,我们也提供各种硬件验证服务,为科研设备的正常运转保驾护航。



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