均相时间分辨荧光技术 (HTRF) 测定脂肪酸修饰型胰岛素的体外生物学活性

研究背景

生物学活性是生物技术药物的关键质量属性，能够体现产品高级结构的正确性、生物学功能的完整性，以及产品的批间一致性。经典的动物体内实验法实验周期长、操作熟练度要求高、变异性大且不符合“3R”原则，开发基于细胞并尽可能模拟体内药效机理的体外活性检测方法成为研究热点。均相时间分辨荧光技术 (HTRF) 的反应体积小、均匀度高、荧光信号稳定，且具有通量高、实验周期短、灵敏度高、稳定性好等优势，备受关注。

脂肪酸修饰型胰岛素是更能贴合人体需要的胰岛素类似物，可抵抗蛋白酶降解，延长体内半衰期，具有更好、更平稳的控血糖效果。本研究利用均相时间分辨荧光技术 (HTRF) 建立脂肪酸修饰型胰岛素体外生物学活性检测方法，可用于研发、过程控制、终产品放行及生物类似药的研究，具有成为现有药典标准方法的替代方法的潜力。

实验原理

本研究以均相时间分辨荧光技术 (HTRF) 为平台，以转基因细胞 CHO_INSR_1284 作为靶细胞，利用胰岛素受体中 β 亚基的磷酸化，在体系中加入以镧系元素形成的穴状化合物标记的特异性抗体（能量供体），再加入以小分子荧光探针 d2 标记的特异性抗体（能量受体），磷酸化的 IRβ 随即与两种抗体形成双抗夹心复合物。以波长为 340 nm 的激发光激发上述复合物，能量供体的荧光基团发出的波长为 616 nm 的长半衰期荧光信号被采集。双抗夹心复合物的形成拉近了能量供体与能量受体的距离，使得光子从被激发的供体荧光基团转移至受体荧光基团，被激发的受体荧光基团即可发射 665 nm 波长的荧光，荧光值与磷酸化的 IRβ 水平呈正相关。根据这一机制，建立了用于脂肪酸修饰型胰岛素的体外生物学活性检测方法，对关键参数进行优化，依据 2020 版《中国药典》四部通则 9401、1431 进行方法学验证。结果均符合方法验证指导原则和生物检定统计法规定。

实验材料

仪器：SpectaMax Paradigm 多功能微孔板读板机，HTRF 卡盒；

试剂：Phospho-IR beta (Tyr1150/1151) HTRF 试剂盒；

参考品：德谷胰岛素对照品；

测试品：3 种人胰岛素类似物原料药或注射液（编号：0903、1004、1005）；

样品稀释液：含 0.1% 牛血清白蛋白的 Ham's F-12 营养培养基；

微孔板：Cisbio half-area 96 孔白板。

实验方法

01

取德谷胰岛素对照品以样品稀释液制成 57.18 μg·mL-1 的初始浓度，进行 4 倍稀释，共 8 个稀释度。

02

取 0903、1004、1005 人胰岛素类似物的原料药或注射液作为测试品，用样品稀释液稀释至与德谷胰岛素对照品相同的起始摩尔浓度，同样进行 4 倍稀释，共 8 个稀释度。

03

使用 SpectaMax Paradigm 多功能酶标仪，设置激发波长 340 nm，读取发射波长 616 nm 及 665 nm 处的荧光信号值。

04

利用 Softmax 7.1 软件进行四参数模型分析，以德谷胰岛素对照品的浓度对数为横坐标，以 ΔF (RFU665 nm÷RFU616 nm) 为纵坐标绘制四参数剂量-效应曲线。

05

按照 2020 版《中国药典》四部通则 1431 生物检定统计法—四参数回归计算法对实验数据进行可靠性测验和生物相对活性计算。

实验结果

01

编号 0903 人胰岛素类似物的实验结果符合 2020 版《中国药典》四部通则 1431 生物检定统计法中的要求，生物相对效价 R=104.436%，相对置信区间范围是 87.764%~113.939%。

02

编号 1004 人胰岛素类似物的实验结果符合 2020 版《中国药典》四部通则 1431 生物检定统计法中的要求，生物相对效价 R=108.345%，相对置信区间范围是 88.007%~113.628%。

03

编号 1005 人胰岛素类似物的实验结果符合 2020 版《中国药典》四部通则 1431 生物检定统计法中的要求，生物相对效价 R=126.281%，相对置信区间范围是 79.974%~124.954%。

实验结论

依据 2020 版《中国药典》四部通则 1431 生物检定统计法中的要求用约束模型对测定结果进行可靠性验证，通过对剂间变异的分析，以测验参比品和待测样品的对数剂量和反应的关系是否显著偏离平行曲线。剂间变异分析为试品间、回归、偏离平行和模型失拟四项，由 Softmax 7.1 软件获得各变异项的 P 值。当 P<0.05 或 P<0.01，即认为在此条件下该项变异有显著意义。

实验结果可靠性判断：

回归项应非常显著（P<0.01）；

偏离平行和模型失拟均应不显著（P≥0.05）。

由此可判断编号 0903、1004 和 1005 的测试品都通过了可靠性测验。

另外，要求测试品相对效价应在 80%-120% 范围内，编号 1005 的测试品相对效价是 126.281，不符合实验室对产品的要求。