技术推广丨AI 辅助高内涵成像系统开展斑马鱼体表形态和心脏表型分析

简 介

心血管疾病是严重威胁人类健康的一类慢性疾病，是全球首要致死原因。大量研究证实，环境污染物暴露可致心血管系统功能损伤，是心血管疾病主要诱因之一^[1]。斑马鱼饲养成本低、产卵量大，体外受精、发育周期短、透明易观察，与人类共享 70% 的蛋白编码基因，心血管发育过程与人类非常相似，现已成为化学品毒性评价的高通量理想模式生物^[2]，在医学、生命科学、毒理学等领域被广泛应用^[3]。

高内涵成像分析系统可以实时、快速采集大量斑马鱼暴露污染物后的发育图像，可以在单次实验中获得生物的大量表型参数，这些参数均是衡量化学品毒性大小的潜在指标。然而，如何从海量图片中快速定量分析各个指标，是亟待解决的问题。

深度学习方法在图像处理、视频分析和语言识别等领域被广泛应用。与传统的机器学习方法相比，深度学习通过自动优化特征提取和分类程序，克服了人工测量表型特征的局限性。鉴于此，本研究开发了基于斑马鱼图像识别大量身体表型及心脏表型的深度学习模型和定量分析方法。基于构建的模型和方法，可实现高风险发育毒性和心脏毒性的新污染物的高通量筛选。

实验方法

1. 污染物暴露与斑马鱼成像

使用健康 AB 型野生斑马鱼、Tg (myl7: eGFP) 心脏转基因斑马鱼胚胎进行不同剂量的污染物暴露 (助溶剂 DMSO 的含量小于 0.2%)。待斑马鱼暴露至 72 hpf 后，转移至黑色透明 96 孔板中。使用 MS-222 麻醉幼鱼，将孔板以 200 rpm 离心 2 min，使斑马鱼侧躺。

随后使用 ImageXpress Micro Confocal 高内涵成像系统 (Molecular Devices) 在明场和 FITC 荧光场下进行图像采集 (图 1)。设置成像程序参数如下：选择 4X Plan Apo 物镜，每孔拍摄视野数量 2×2，各个视野紧邻；选择激光自动聚焦 (对焦到板底部，按底板厚度偏移) 和 Z 层垂直拍摄；针对荧光心脏图像采集，选择 FITC 通道，聚焦方式选择 Laser with z-offset，选择数字共聚焦，调整曝光时间和曝光强度，直到心脏图像聚焦清晰，进行拍摄。

特别指出的是，对于心脏转基因斑马鱼，采集荧光图像、视频及平均荧光强度数据。对心脏转基因斑马鱼进行心脏跳动视频的制作，选择 Stream Acquisition，拍摄帧数为 250 帧，选择 Make movie 选项，选择 100 帧图片进行 15s 视频制作。

2. 特征提取

使用 Labelme 对所采集的图像数据集进行标注，获取斑马鱼幼鱼鱼身、头部、眼睛、心包、卵黄囊共计 5 个身体表型参数，以及心脏区域的心房和心室收缩和舒张时的组织轮廓、心室的长轴和短轴共计 8 个参数。基于心跳平均荧光强度数据，计算心率、RR 间期、QT 间期和 QTc 间期指标。其他心脏功能评估指标 (心室舒张末期体积 (EDV)、心室收缩末期体积 (ESV)、心室舒张末期面积 (EDA)、心室收缩末期面积 (ESA)、每搏输出量 (SV)、心室短轴收缩率 (FS)、射血分数 (EF)、面积变化分数 (FAC)、心输出量 (CO)) 则基于心率及心室的长轴、短轴和面积计算而得。

3. 深度学习模型构建

基于拍摄的图像，使用 ImgAug 开发库进行数据增强，最终获得 3650 张图像用于构建识别斑马鱼体长的模型，获取 3465 张图像用于构建识别斑马鱼头部、眼睛、心包、卵黄囊区域的模型，获取 3051 张图像用于构建识别斑马鱼心房及心室区域的模型。将增强后的图像数据集进行划分，其中 80% 作为训练数据，10% 作为验证数据，10% 作为测试数据。通过 YOLOv8 网络，结合 OpenCV 形态学操作等方法，开展斑马鱼幼鱼的体表和心脏形态的分析，通过识别并检测各个部位的形貌特点，提取表型特征 (5 个身体表型，8 个心脏表型参数)。其他心功能参数则基于心脏表型参数计算获得。最终，构建在明场下对斑马鱼体表形态识别的模型和在荧光场下对斑马鱼心脏形态识别及功能评估的模型，实现对斑马鱼图像的批量处理测量和评估。基于构建的方法，可开展各类化学品对斑马鱼的发育毒性和心脏毒性的高通量筛查。

图 1 化学品暴露、图像采集及表型分析的流程。

结果

1. 斑马鱼身体表型特征识别和分析

构建的模型可基于一张明场下斑马鱼图像，识别、检测、定量输出鱼的头部、眼睛、心包以及卵黄囊的面积及鱼身长度 (图 2)。从表 1 可以看出，构建的模型对 5 个部位识别的性能指标如下：精度均大于 0.935，召回率均大于 0.960，F1 Score 和 mAP50 均大于 0.950，表明模型具有优异的分割和识别效果^[4]。

图 2 表型特征 (体长、卵黄囊、头部、眼睛、心包) 的预测结果。

表 1 斑马鱼身体表型参数的模型的统计学结果。

2. 斑马鱼心脏表型的识别和功能参数的计算

基于斑马鱼荧光心脏视频可构建心脏表型模型，用于识别、检测、定量输出心房和心室收缩和舒张的面积和长度 (图 3)。模型对舒张和收缩时心房和心室部位的识别精度均大于 0.970，召回率大于 0.940，F1 Score 和 mAP50 均大于 0.960，表明构建的模型对心脏表型具有良好的分割和识别效果 (表 2) ^[5]。基于获取的平均心脏荧光数据，可以计算出心率，RR 间期、QT 间期和 QTc 间期指标。基于以上参数，可进一步计算获得以下心脏功能参数，包括 EDV、ESV、EDA、ESA、SV、FS、EF、FAC、CO。

图 3 心脏特征 (收缩和舒张时心室和心房的面积) 模型的预测结果。

表 2 斑马鱼心脏表型参数的模型的统计学结果。

该研究构建了一种基于斑马鱼的集化学品毒性高通量测试、图像采集、身体表型及心脏表型识别及定量分析为一体的方法。基于该方法，系统研究了 15 种新污染物对斑马鱼的毒性。该方法具有识别速度快、准确率高、涵盖评价指标多等优势，能够提高化学品发育和心脏毒性评价的效率和准确度，可用于化学品的早期风险评估和健康预警。

总结

1. ImageXpress Micro Confocal 高内涵细胞分析系统可用于高通量的斑马鱼图像拍摄和心跳视频的获取。

2. 基于拍摄的明场图像，构建了一种基于 YOLOv8 的斑马鱼表型识别 (体长、头部、眼睛、心包、卵黄囊) 及定量分析方法，可用于高风险发育毒性化学品的高通量筛选。

3. 基于心脏荧光视频，采用 YOLOv8 模型和 OpenCV 形态学操作可以对 > 10 种心脏表型及功能参数进行识别、定量分析和计算，可用于高风险心脏毒性化学品的高通量筛选。

致谢

感谢国家自然科学基金 (22376022)、中央高校基本科研业务费 (2412022ZD055) 的资助。感谢 Molecular Devices 公司应用科学家团队对成像方法开发的技术支持工作与市场部推文发表的支持。

 作者

张力骁 1，王佳颖 1，王金鹏 2，王宇强 2，王玉茹 2,*，李超 1,*

1 东北师范大学环境学院，长春 130117

2 东北师范大学信息科学与技术学院，长春 130117