基于 AI 的人胰腺癌类器官药物筛选策略

简  介

癌症仍然是 21 世纪的主要死因之一，虽然肿瘤学方面取得了最新进展，但大多数癌症患者仍缺乏持久的个性化治疗方案，只能通过离体实验评价抗癌化合物及其组合物的影响。目前患者来源的器官样本 (PDOs) 表现出长期扩展潜力，同时也保留肿瘤组织病理学以及癌症基因突变，可作为离体测试可行、有效的模型。但是到目前为止，类器官样品因均质性差、操作困难、自动化方案不理想而使 PDOs 在药物筛选应用中受到了限制。此外，器官样本在培养基中的随机分布，也使得类器官的成像和图像分析变得复杂。

为克服这些挑战，我们使用 Gri3D 平台 (SUN bioscience) 建立了 PDOs 化合物筛选工作流程，该平台由具有适合高通量和可重复类器官培养的微腔板组成。基于标准 96 孔微孔板，每个孔内都含有一个抗细胞粘附的水凝胶微孔。在 Gri3D 上，类器官可在微孔中位于同一成像平面且稳定生长。这极大地促进了基于图像筛选的高内涵 3D 图像采集和定量分析。此外，该移液口可实现自动细胞接种、培养基交换和化合物孵育等实验操作，从而提高检测的可重复性。

在这项研究中，我们将人胰腺癌 PDOs 暴露于一系列不同剂量的抗癌化合物中，并使用活性染料 Calcein AM ( 活染 ) 和 Ethidium Homodimer-1 ( 死染 ) 进行染色，通过高内涵共聚焦成像测试 PDOs 对药物的反应。使用基于 AI 的方法，我们高效地检测到每个类器官样品，并从三个通道 ( 明场、活细胞染色和死细胞染色 ) 中提取与细胞毒性相关表型特征。首先通过 PCA 或 UMAP，将提取样品尺寸特征 ( 超过 100 个 ) 减少到 3 个组分。然后，利用机器学习在 3D 散点图中可视化、排序和聚类处理。数据表明，50μM Palbociclib 具有与阳性对照相似的显著细胞毒性作用，这与传统的活 / 死细胞分析结果一致，证明了使用 AI 驱动对药物筛选进行可靠、公正的数析方法的可行性。

实验室耗材和仪器

Gri3D 是一个用于高通量和可重复类器官培养的即用型平台。基于孔内水凝胶形成的一系列超密集 U 形底微孔，使每个微腔中均能生成单个类器官，并在无固体 ECM 的悬浮培养物中生长。我们使用配备转盘共聚焦和 sCMOS 相机的 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高内涵成像分析系统可捕获整个类器官的 3D 结构。

方法

在 96 孔 Gri3D 500 μm 孔径的微孔塑料板中培养标准化胰腺癌类器官，并用抗癌药物处理其 72 小时。利用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高内涵成像分析系统 (Molecular Devices ) 的透射光 (TL) 对不同时间点类器官进行连续拍摄，而后对类器官进行活 / 死测定。通过 IN Carta 图像分析软件进行图像分析 ( 图 1 )。分析中，对每孔 40 个类器官进行图像分割，并从每个类器官中提取 50 多个指标。最后，利用 StratoMineR 数据分析软件 (Core Life Analytics)对每个类器官相关的特征进行分析。

图 1 类器官药物处理工作流程示意图。该工作流程结合了 Gri3D、高内涵成像系统以及人工智能的图像分析软件 (Molecular Devices )

化合物的表型效应

在 Palbociclib 暴露后，细胞死活的分析中显示类器官的存活率随着药物浓度的增加而下降，而在 trametinib 处理的类器官中未观察明显现象 ( 图 2B )。这种基于深度学习的 TL 图像分析方法，可以有效地检测到单个类器官随时间变化的参数。此外，灰度非正态因子 (GLNN) 可作为类器官灰度值测试指标。如图 2C 所示，这个值随着 Palbociclib 和 Trametinib 剂量的增加而降低 ( 见图 2C )，这些药物会引起类器官的生长缺陷。

图 2 抗癌化合物暴露人胰腺癌 PDOs 72 小时结果。A. TL 图像在曝光前 ( 0 小时 ) 和曝光后 ( 72 小时 ) 以及活 / 死 (Live/Dead) 实验后的类器官的最大投影图像。绿色：Calcein AM，活细胞；红色：EthD-1，死细胞。B.Ethidium homodimer-1 (EthD-1) 与 Calcein AM 强度比。C. TL 图像的灰度非正态因子(GLNN) 变化。误差显示标准差。每个点代表每个类器官。单因素方差分析 Dunnett 多重比较，**P<0,01，P****<0.0001，ns：不显着。比例尺：250μm。

通过参数降维选择合适条件

IN Carta 数据分析软件提取了 TL、EthD-1 和 Calcein AM 通道中每个类器官相关的数百个特征参数。为了对药物孔和对照孔进行可视化和聚集分析，我们首先通过主要成分分析法将参数降维至三个组分，即 PCA01, PCA02 和 PCA03。然后，我们在 3D 散点图中对药物孔和对照孔进行可视化，其中阴性对照和阳性对照分别形成其自己的簇 ( 图 3 )，药物中 50 uM Palbocilib 是唯一一个聚类更接近阳性对照的处理组 ( 图 3 )，这个观察结果与活 / 死细胞的结果分析一致 ( 图 2 )。此外，从各药物组 (Chebyshev 最大距离 ) 与平均阴性对照的排列中显示，50 uM Palbociclib 排在首位，而四个阳性对照孔排名前六。从这些结果表明，50 uM Palbociclib 对人胰腺癌类器官的效应最为明显。

图 3 通过主要成分分析进行聚类和排序。A.、B.、C. 与原始功能有加权关联的三个 PCA 组分。D. 三种 PCA 成分的 3D 散点图。E. 药物组、对照组与平均阴性对照的 Chebyshev 最大距离排序。

UMAP

为了验证我们的分析，我们使用统一流形逼近与投影法 (UMAP) 减少特征参数的维度情况。考虑到所有特征，聚类图也显示了聚类接近阳性对照的 50 uM Palbociclib 处理组。为确定我们是否能够仅用明场图像区分表型变化，我们仅使用 TL 通道的特征进行分析，但是所得的 3D 散点图显示没有明显的聚类特征，这表明需要添加其他的特征进行聚类。

图 4 UMAP 降维和聚类。A. 所有特征的 UMAP 组份的 3D 散点图。B. 仅 TL 通道特征的 UMAP 组份的 3D 散点图。

概要

Gri3D 是一个用于高通量和可重复类器官培养的平台。

ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高内涵成像分析系统可捕获高通量和高分辨率的类器官 3D 结构。

IN Carta 图像分析软件为每个类器官生成 mask，并测量与每个类器官相关的数百个特征参数。

StratoMineR 数据分析软件利用人工智能对每种药物处理进行聚类和排列分析。

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