​发光活性测定快速评估二维和三维乳腺癌模型系统的药物反应

背景介绍

多年来，在平面培养板上生长的单层细胞模型（2D 模型）一直是研究疾病机制和评估潜在新药疗效的便捷系统，2D 生长的癌细胞系长久以来则是癌症模型的实验替代品。但近年来，癌细胞以及其他细胞类型，以三维（3D）格式培养能够形成多层结构，成为疾病研究的新模型。而这些模型在生物学上更具相关性。

虽然通常需要成像和高内涵分析来获得候选药物对复杂 3D 细胞模型影响的详细信息，但同时也需要直接的基于细胞的分析以评估单个参数，如整体细胞活力。三磷酸腺苷 ATP 检测是一种广泛使用的评估治疗手段对细胞活性影响的方法，在这个方法中，代谢活跃的细胞利用 ATP 作为能量来源；当营养物质受损或耗尽时，细胞会出现细胞质 ATP 的快速下降，用于测量 ATP 的分析方法通常是读取基于荧光素酶反应的发光读数。这个方法需要活细胞提供 ATP（图 1 ），并且由于细胞和试剂中缺乏背景发光，反应非常灵敏。ATP 检测的快速读数可用于快速筛选一大组化合物，并识别显著影响细胞活性的子集。然后，这个简化的集合可以应用于更集中的后续研究，包括提供更多表型细节的通量实验。

图一：荧光素酶反应用于测量细胞活力。细胞被溶解并加入荧光素酶反应，在那里它们提供产生发光所需的 ATP ，活细胞越多，产生的光信号就越多。

在这里，我们介绍一项小规模研究，是使用CellTiter Glo 3D 细胞活性分析试剂盒（Promega）测量的 2D 和 3D 细胞样本的细胞活性。我们分析了以下两种细胞类型的 2D 和 3D 细胞样本的活性，并用几种先前测试过的化合物进行了测试：MCF-7，一种常用的雌激素受体（ER）和孕酮受体（PR）阳性的乳腺癌细胞系；以及 TU-BcX-4IC，患者来源的肿瘤外植体，来作为三阴性（ER、PR 和 HER2 阴性）亚型化生性乳腺癌的代表模型。使用 SpectraMax iD5 微孔板读板器进行检测，该读板器具有超冷型 PMT ，可实现低背景发光和高灵敏度。所有数据均使用 SoftMax Pro 软件进行分析，包括曲线拟合和 IC₅₀ 计算。

实验材料

• CellTiter-Glo 3D 细胞活性分析试剂盒 （Promega cat. #G9682）

• MCF7 乳腺癌细胞系（ATCC cat. #HTB-22）

• TU-BcX-4IC 患者来源的原发性三阴性乳腺癌细胞（由杜兰大学 M.Burow 实验室慷慨提供）

• MCF7 细胞系培养基：MEM（Corning cat. #10-010-CV） + 10% 胎牛血清（FBS, Avantor Seradigm cat. #1500-500）+ 1% Antibiotic-Antimycotic （Gibco 15240-062） + 0.01% mg/mL 人重组胰岛素（Gibco cat. #12585-014）

• TU-BcX-4IC 细胞系培养基：DMEM （Corning cat. #15-017-CV） + 10% 胎牛血清（FBS, Avantor Seradigm cat. #1500-500） + 1% Antibiotic-Antimycotic（Gibco cat. #15240-062）+ 1% NEAA（Gibco cat. #11140-050）+ 0.01% mg/mL 人重组胰岛素（Gibco cat. #12585-014）

• 384 孔 PrimeSurface 3D 白色培养板，超低附着，U 底微孔板（Sbio cat. #MS-9384WZ）

• 384 孔白板，组织培养处理，固体底部微孔板（Thermo Fisher Scientific cat. #164610）

• 测试化合物：硼替佐米（Tocris cat. #7282） /伊布替尼（Tocris cat. #6813） / 盐酸阿柔比星（Selleck Chemicals cat. #S1228） /帕诺比诺斯（Selleck Chemicals cat. #S1030）/ 罗咪酯肽（R&D Systems cat. #3515） /曲美替尼（Selleck Chemicals cat. #S2673）

• SpectraMax iD5 多功能微孔板读板机（Molecular Devices）

实验方法

• 细胞制备

3D 球体：MCF7 或 TU-BcX-4IC 细胞以每孔 2500 个细胞的量加入 384 孔 U 底微孔板，以 1000 rpm 离心平板 1 分钟聚集细胞，然后将培养板在 37°C、5%CO₂ 下培养 72 小时。

2D 单层培养：以每孔 5000 个细胞将 MCF7 接种到 384 孔平底微孔板中，然后在 37°C、5%CO₂ 下培养板 24 小时，TU-BcX-4IC 细胞以每孔 2500 个细胞进行培养，然后培养 48 小时。

• 化合物处理

以 2D 和 3D 培养的 TU-BcX-4IC 和 MCF7 细胞在四个重复的微孔中处理，以 1:5 梯度稀释 romidepsin 为 50 nM 至 0.006 nM。细胞与化合物在 37°C 、 5%CO₂ 下培养 72 小时。两种培养形式的 TU-Bcx-4IC 细胞也用硼替佐米、ibrutinib、盐酸依达比星、帕诺比诺和曲美替尼处理。细胞与化合物在 37°C、5%CO₂ 下培养 72 小时。

孵育后，将 CellTiter Glo 3D 试剂添加到样本孔中。对于 3D 球体，摇动平板 5 分钟，然后在室温下培养 30 分钟，以便在读数前进行细胞裂解。对于 2D 培养，将平板摇晃 2 分钟，然后在室温下培养 10 分钟，然后读取荧光值。使用表 1 所示的发光检测模式和设置，在 SpectraMax iD5 读板器上读取数值。所有数据分析和绘图均使用 SoftMax Pro 软件完成。

实验结果

每组处理细胞的样本结果均使用 SoftMax Pro Software 中的 4 参数拟合，其中每条曲线的 C 参数被视为 IC₅₀ 值。在用 Romidepsin 处理的 MCF7 细胞中，3D 培养细胞的 IC₅₀ 浓度略高于单层培养细胞（图2）。与 2D 细胞相比，经 Romidepsin 处理的 TU-BcX-4IC 在 3D 培养细胞中的 IC₅₀ 稍低（图 2E）。对于其他测试的化合物，3D 培养细胞的 IC₅₀ 值通常更高，3D 和 2D 培养结果之间的差异通常约为两到三倍（图 3 ，表 2 ）。

经 Romidepsin 处理的 TU-BxC-4IC 和 MCF7 细胞之间存在明显差异。在 2D 培养中，两种细胞类型的 IC₅₀ 值相似，分别为 1.13 nM 和 1.88 nM。然而，在 3D 培养中，TU-BxC-4IC 细胞的 IC₅₀ 值为 0.443 nM，比 MCF7 细胞的 5.28 nM 低 12 倍，这表明 TU-BcX-4IC 细胞培养方法对这些细胞的反应的影响比 MCF7 细胞的影响更大。

表一：CellTiter Glo 3D 分析的 SpectraMax iD5 读板器软件设置。具体设置在 SoftMax Pro 软件的板部分中指定。通过选中“更多设置”下的“显示预读取优化选项”旁边的框，并遵循启动读取后出现的说明，可以优化读取高度。

图二：3D 和 2D 培养 MCF7 细胞的化合物反应。以 3D（红色）和 2D（蓝色）培养的 MCF7 细胞，用罗美肽处理。3D 和 2D 的IC₅₀ 值分别为 5.28 nM 和 1.88 nM。

图三：三维和二维培养 TU-BcX-4IC 细胞的化合物反应。红色表示三维培养的细胞，而蓝色表示二维培养的细胞。A、 romidepsin 处理的细胞；B、 硼替佐米；C、 伊布替尼；D、 依达比星；E、 变阻器；F、 特拉梅蒂尼布。

表二：药物处理细胞的 IC₅₀ 值。列出了培养为球形（3D）或单层（2D）的 MCF7 和 TU-BcX-4IC 细胞的值。所示 IC₅₀ 浓度单位为 nM 。

实验结论

使用荧光素酶在不同实验条件下读取细胞内相对 ATP 浓度发光读数的分析为快速评估细胞活力提供了一种便捷方法。细胞可以放置在 U 形底板中，在那里它们很容易形成球体；并且可以进行药物处理和 ATP 检测，而无需清洗微孔或转移球体。由此得到的细胞活性数据本身需要通过其他方法（如高内涵成像）进行进一步研究的化合物或治疗方法。

在本应用文章中，我们证明了使用 CellTiter Glo 3D 分析比较不同化合物处理两种不同细胞类型（生长为球形或单层）的活性的结果的可行性。所述的细胞培养方法和检测方法易于建立，适合中高通量筛选。SpectraMax iD5 通过 SoftMax Pro Software 自动化的数据分析和曲线拟合，提供稳健分析读数所需的灵敏度。