从定量到定性——宿主细胞蛋白检测的双保险

宿主细胞蛋白(host cell protein, HCP)是指生物药中来自生产细胞系的宿主细胞的蛋白成分，主要包括宿主细胞分泌的蛋白以及细胞凋亡、代谢产生的部分结构蛋白。作为生物药生产过程中的残留杂质，HCP是具有多种生理化学和免疫学特性的复杂混合物，可能在人体内引发免疫反应，如：发热、水肿，甚至休克等。人体的免疫应答性质和效果，会受到HCP的浓度、数量和个体免疫系统差异影响而不同。此外，某些HCP还可以充当佐剂来增强生物药产品的免疫反应。因此，建立合适的HCP残留量检测方法将有助于监测生产工艺，确保生物药的质量和安全。

国际人用药品注册技术协调会(ICH)、美国食品药品监督管理局 (U.S. FDA)、欧洲药品管理局 (EMA) 和其他国家的监管机构都有关于 HCP 监测的指南，普遍认为需要采用敏感且经过验证的有效方法来监控残留的HCP，通常为1至100ng/ml。

典型的单抗不同纯化阶段HCP浓度变化情况

 MABS 2017, VOL. 9, NO. 4, 654–663

工艺中的HCP的监控和产品放行，双抗夹心酶联免疫法（ELISA）一直被用作HCP检测的金标准。这主要是因为ELISA可以在mg/ml级别的产品蛋白中有效地检测ng/ml级别的HCP残留，并且ELISA方法成熟，可操作性强，是经典的免疫学检测方法。

HCP ELISA的原理是先将HCP抗体包被酶标板，孵育待测样品，通过HCP抗体捕获和富集样品中的HCP，再加入与包被酶标板的抗体种属不同的，酶联报告基团的HCP抗体，结合已被富集的HCP，通过底物显色或荧光的方式，最终定量计算HCP。

丹纳赫生命科学旗下美谷分子仪器(MD)拥有各类不同功能的酶标仪，适用于检测不同信号的ELISA实验。特别是SpectraMax i3x多功能酶标仪具有光吸收、荧光、化学发光和FRET检测功能，兼容客户端模块化升级功能，可以根据需要任何时间随意升级至荧光偏振FP、HTRF、AlphaScreen、Western Blot、细胞成像和带有注射器模式下的快速动力学检测。

MD的SpectraMax i3x多功能酶标仪

由于需要检测HCP的工艺步骤多，ELISA的操作流程繁多，有大量的移液和清洗步骤，靠人工操作，难免会出现移液体积不准、漏加等人工操作误差导致的信号弱或者过饱和，以及标准曲线线性不佳、污染等问题。丹纳赫生命科学拥有贝克曼库尔特自动化工作站搭配MD酶标仪的整合方案，可以自动化地对样本进行高通量的ELISA操作，大大避免实验误差及重复的人工劳动。

贝克曼库尔特自动化工作站进行ELISA实验流程

自动化工作站进行ELISA实验的结果

但ELISA检测HCP不能从结果中得知样品中有哪些HCP，或者用于ELISA检测的抗体与哪些HCP发生了免疫反应，而且HCP的组成与丰度在生产的各个阶段与最终产品都各自不同，因此需要采用正交方法进行相互验证，互为补充。LC/MS方法可对生物治疗性蛋白质样品中的HCP进行鉴定和定量。

有文献采用SCIEX 的高分辨质谱仪结合高效液相色谱仪，开发了基于一维UHPLC-MS检测HCP的方法。在上游细胞上清液收获阶段，采用数据依赖性采集模式进行较高浓度的HCP检测，可以鉴定到上千个蛋白，建立数据库，同时可以得到HCP特异性肽段的离子对信息；在下游纯化阶段对较低浓度的HCP采用数据非依赖性SWATH的采集模式，可以获得低浓度HCP的定量信息，同时还可以根据HCP的特异性肽段的离子对信息，追踪特异性HCP在不同纯化阶段的浓度变化情况。

1D UHPLC-MS HCP检测流程

 MABS 2017, VOL. 9, NO. 4, 654–663

SCIEX TripleTOF^TM系列高分辨质谱系统                       SCIEX  X500 系列高分辨质谱

该方法不但能对未知HCP进行鉴定，还能同时进行多种HCP的检测，通量可达20个样本/天，采用48种已知蛋白作为标准品进行灵敏度定量测试，检出限可达7.56-0.5ppm。

HCP LC-MS与ELISA结合使用，可降低HCP监督的风险并提供有关HCP特性的有价值信息，以指导下游工艺的开发。