告别人工繁琐操作：CellXpress.ai实现脑类器官全流程自动化培养

简介

阿尔茨海默症和帕金森病等神经系统疾病仍然是全球主要的健康挑战。尽管在药物发现和开发流程上投入了大量资金，但进展一直受到几个瓶颈的阻碍。一个根本性的挑战是缺乏可靠的体外和体内模型来准确指导化合物筛选和先导化合物优化。使用细胞系和动物测试的传统工作流程通常无法重现人脑及其疾病的复杂性。随着2014年Lancaster等人^[1]开发出第一个脑类器官模型，这种情况发生了改变。脑类器官是人体大脑部分的复杂3D微型模型，源自人诱导多能干细胞。与传统的2D培养不同，脑类器官包含多种相互作用的细胞类型，并能重现真实组织的结构和构造。这种复杂性使它们成为研究大脑发育和疾病的更优模型。近年来，脑类器官生成方案取得了显著进展，确立了这些模型在药物发现、疾病建模和个性化医疗中的重要工具地位。^[2]

尽管取得了这些进展，但将脑类器官转化为药物开发工具仍然面临挑战，因为其重现性差、方案复杂且劳动密集，阻碍了可扩展性。尽管从诱导多能干细胞（iPSC）分化为脑类器官的方案因模型系统而异，但它们通常需要在数月内进行培养基更换，并配合持续监测。这种漫长的培养过程导致了孔间和板间的高变异性，这仍然是一个主要限制。

优势：

• 提高一致性。自动化类器官培养意味着即使在周末和节假日也能按设定时间表进行操作。这种一致性不仅减少了人为错误，而且带来了更可靠的下游检测。

• 降低交叉污染风险。不会混淆培养基或错误操作培养板。自动化处理使每个步骤都标准化且安全。

• 降低污染风险。培养箱内置H₂O₂净化系统，液体处理工作站配备HEPA过滤正压，以防止样品污染。

• 有效的时间管理。增加的交付时间使科学家能够专注于更关键的任务，同时加快其研发时间。

• 成像变得可靠且可重复。自动化成像系统可处理常规图像采集，而基于深度学习的分析可实现严格的质量控制和监控。

• 与外部仪器集成。与图像采集和分析工具的兼容性可实现端到端iPSC培养自动化，以推进神经退行性疾病建模。

CellXpress.ai体外模型智能化工厂旨在克服这些挑战。该系统将液体处理器、成像仪和培养箱组合成一个统一的平台，允许对2D和3D细胞培养进行接种、换液、传代和监测（图1和2）。

通过优化CellXpress.ai的液体处理步骤，可以减少可变性，从而降低污染风险，并最大限度地减少在培养基吸取和分配过程中类器官的损失或损坏。系统的“智能介质模块”通过允许试剂在台上储存多天，显著减少了手动操作的时间。此外，这些培养基模块会预先加热培养基，以确保在换液开始时培养基处于指定温度，并保持该温度直到所有培养板处理完毕。换液后，培养基会自动冷却以便在台上储存（图1）。除了培养基容器，储液板也可以存放在台上。

CellXpress.ai自动化细胞培养系统可集成振荡培养箱，在整个培养过程中提供连续的培养基搅动，从而培养游离类器官，如脑类器官这款摇晃式培养箱可容纳多达六个支架，采用混合搭配配置，允许静态和摇动条件并存。

因此，干细胞可以与脑类器官在同一个培养箱中培养。这一特点对于为脑类器官生成的整个过程提供端到端的工作流程至关重要。

此外，CellXpress.ai系统可通过其内置成像仪对培养物进行持续监测，并通过整合IN Carta图像分析软件来利用机器学习辅助图像分析。

在本应用说明中，我们描述了使用CellXpress.ai系统自动化生成脑类器官的工作流程，从iPSC开始到复杂脑类器官的分化和成熟（图2）。对于干细胞培养，建立了单细胞或细胞团块传代方法。对于干细胞分化为脑类器官而言，起始材料至关重要。干细胞应表现出健康、非分化的克隆。为控制干细胞质量，我们部署了IN Carta图像分析软件，该软件利用先进的人工智能，使克隆分割能够区分健康和分化的克隆。我们实施了一个工作流程，使用摇床代替传统轨道振荡器来生成脑类器官。通过功能性检测和全标本染色评估类器官质量。我们还通过CellXpress.ai系统的后端口，展示了与外部设备（ImageXpress Confocal HT.ai高内涵成像系统）的无缝集成，用于高级监测。

方法

iPSC培养

使用人诱导多能干细胞系WTC-11（Gm25256，Coriell Institute for Medical Research）来生成脑类器官。细胞团块传代按照应用指南《使用CellXpress.ai自动化细胞培养系统实现iPSC培养、传代和扩增的自动化》中描述的方案进行。为了生成脑类器官，使用TrypLE对iPSC进行单次传代，并接种到96孔U底板中。

脑类器官

大脑类器官的生成使用StemCell Technologies试剂盒（目录#08570），按照方案说明进行。为了成熟，将培养板放置在轨道摇床或摇床上进行比较。

前脑类器官

前脑类器官在96孔U底板（Greiner, Kremsmünster,DE）中生成。在第12天，将类器官转移到6孔超低吸附板（Greiner,Kremsmünster,DE）中，或继续在96孔U底板中培养。为了成熟，将培养板放置在轨道摇床或摇床上进行比较。

中脑类器官

中脑生成按照Renner等人（2021）的方法进行^[3]。

图像分析

使用基于机器学习方案的IN Carta图像分析软件对未分化和分化的iPSC集落进行分割。基于图像分析，在方案中设定了决策规则，以实现iPSC培养的自动化传代，并排除存在分化的孔。

细胞特性鉴定

为了进行iPSC克隆的质量控制，用4%多聚甲醛固定克隆，并对多能性标志物进行染色。

通过使用FLIPR Calcium 6检测试剂盒（Molecular Devices）评估钙流来测量脑类器官的功能活性，操作按制造商方案进行。

为了进行类器官的质量控制，按照Renner等人发表的方案进行全标本染色^[4]。简言之，首先使用苯甲醇和苯甲酸苄酯对类器官进行透明化处理。成功透明化后，对类器官进行染色。使用ImageXpress HT.ai系统进行高内涵成像。

结果

自动化干细胞培养

对于脑类器官的生成，起始材料的质量至关重要，这意味着需要高质量的干细胞来生成高质量的脑类器官。通过使用CellXpress.ai系统，我们能够维持人iPSC细胞多次传代。在这里，通过细胞数量和汇合度的持续增加可以观察到干细胞克隆的持续生长（图3A）。对于在CellXpress.ai系统上培养干细胞，我们建立了单细胞和细胞团块传代方案（图3B）。在这里，当汇合度达到一定阈值时，可以通过决策自动触发传代。

CellXpress.ai系统与IN Carta图像分析软件的兼容性有助于采用深度学习进行克隆分割，以区分健康细胞（图3C）和分化细胞（图3D）。使用这些既定的实验步骤，我们能够显示人iPSC的持续生长，并在多个培养板上进行了验证（图3E）。

iPSC分化为脑类器官

CellXpress.ai系统软件具有多个程序阶段，可根据需要组合以设置程序。这些阶段包括换液、成像、接种和传代。通过使用CellXpress.ai系统，我们能够建立脑类器官生成的工作流程。该实验步骤包括将iPSC接种到96孔U形底板中，以及对96孔板和6孔板进行定期的培养和图像采集循环（图4A）。因此，CellXpress.ai系统通过以无与伦比的精度执行类器官开发过程中容易出错和重复性的任务，增加了解放双手的时间。

内置的CellXpress.ai系统成像仪允许快速、全孔采集96孔板和6孔板的图像。因此每个类器官都可以以高分辨率进行监测，从而提供类器官出芽等重要细节（图4B-C）。

对于脑类器官的成功成熟，保持类器官运动至关重要，因为这些类器官“非常饥饿”，需要持续的营养和氧气流动。

尽管标准方案涉及轨道摇床，其自动化仍然是一个挑战。然而，有一些涉及振荡器的自动化解决方案。在这里，我们的目的是测试在振荡器上生长的类器官是否与在摇床上生长的类器官相当（图4D）。我们能够在振荡器上成功生长大脑类器官，这些类器官表现出特征性结构，例如在第10天左右类器官表面出芽（图4E）。我们比较了培养48天后在振荡器和摇床上生长的类器官的面积，没有观察到差异（图4E）。

脑类器官的高分辨率图像采集

将CellXpress.ai系统的自动化功能与ImageXpress HT.ai系统的成像能力相结合，有助于获得高分辨率。

脑类器官的图像。ImageXpress HT.ai系统可在不同放大倍率水平下保持高分辨率和图像质量，既能获得类器官的整体视图，也能获得区域的详细视图，皮层清晰可见（图5A-D）。多种成像模式共同证实了脑类器官中神经元的活性和功能。

脑类器官分析

使用Calcium 6检测试剂盒测定大脑类器官的功能活性，以跟踪细胞内钙浓度随时间的变化，从而反映神经元活性。为了测量神经元活动，使用了ImageXpress HT.ai系统的流模式功能，结果显示生成了具有功能活性的脑类器官。（图6A–F）

在CellXpress.ai系统上生成中脑类器官

使用CellXpress.ai系统，我们建立了自动化中脑类器官生成工作流程（图7A）。使用系统集成的细胞进程功能，我们可以随时间推移追踪中脑类器官的生长（图7B）。

为了对中脑类器官进行质量控制，我们进行了全标本染色和钙成像。对于中脑类器官的全标本染色，我们进行了光学透明化处理以增强光的穿透（图7C）。成功透明化后，用荧光抗体对类器官进行染色，并使用高内涵ImageXpress HT. ai系统进行成像。

使用免疫荧光标志物进行全标本染色可获得高质量的中脑类器官图像，清晰地显示形态学和表型特征（图7D）。此外，我们对钙染色的中脑类器官进行了监测，并从类器官的四个不同区域选择了单个神经元进行神经元活动追踪，证明了整个中脑类器官的功能性（图7E）。

脑类器官的表型分类

了解类器官表型对于区分“好”类器官和“坏”类器官至关重要。因此，将那些显示不理想表型的类器官排除在进一步处理之外，如培养和成像，反过来将减少昂贵培养基和时间的浪费。IN Carta软件的Phenoglyphs工具允许对脑类器官进行表型分类。

（图8A）。虽然可以手动进行分类，但可以利用IN Carta软件深度学习算法加快该流程。图8B中的混淆矩阵显示手动确定和自动注释表型标签之间的一致匹配，突出了IN Carta软件在自动化脑类器官扩增工作流程中的实用性。

结论

本应用说明表明，使用CellXpress.ai体外模型智能化工厂生成的脑类器官的大小和神经元活性与手动生产的相当。该系统成功支持同时培养iPSC细胞系、6孔板中的自由漂浮脑类器官和96孔板中的单个类器官。内置成像系统可实现不同板型和模型系统的自动图像采集，随后针对每个模型进行可靠的、无标记的图像分割和分类。

这款完全集成的端到端解决方案突显了在单个自动化平台内，从健康干细胞到成熟、功能性脑类器官的可扩展、稳健和高通量生产的可行性。