当视网膜类器官遇见高内涵钙成像：如何精准评估光响应功能？

简介

源自人诱导多能干细胞（hiPSCs）的三维（3D）视网膜类器官，具有帮助科学家更好地理解和模拟视网膜疾病的潜力。这些模型模拟了视网膜的时空分化过程，并形成具有视网膜中存在的多种细胞类型的层状结构。这些结构再现了不同的视网膜细胞类型，包括通常位于类器官外层区域的光感受器、通常呈深色的视网膜色素上皮（RPE）细胞，以及神经节细胞。

本研究利用野生型（WT）或含有视紫红质基因杂合突变的诱导多能干细胞（iPSCs）生成视网膜类器官。类器官在添加了促进视网膜样组织发育的生长因子培养基中培养150-200天，通过目视观察不同结构的形成（包括外缘出现的亮相位层），并采用各类细胞特异性标志物进行免疫荧光分析，验证了多种视网膜细胞类型的发育情况。

通过自动化共聚焦成像系统对钙离子波动进行成像与分析，以检测光感受器的功能活性。我们开发出一种方法，用于分析蓝光（405/20nm）激发下钙离子活动的峰值信号。视网膜类器官外段/光感受器层不同区域的钙离子振荡信号被连续记录并分析。

优势

• 实现视网膜类器官的实时功能评估

• 通过绘制不同类器官区域的钙离子振荡图谱，深入理解细胞功能

• 具备广泛适用性，可用于疾病建模及治疗性高通量筛选，包括神经、心脏和感觉器官类器官等模型

通过对区域特异性钙离子振荡模式进行分析，我们获得了荧光强度标准差、峰值计数及振幅随时间变化等指标。在野生型模型中，基线状态与激发状态之间呈现出明显的模式差异，且荧光强度标准差显著增加。尽管组内钙离子动力学特征与振荡模式高度一致，但在疾病模型中尚未发现规律性模式。这种基于高内涵成像与分析技术，用于人iPSC来源视网膜类器官钙离子振荡功能表征的新方法，适用于高通量检测，并为比较具有不对称性/区域活性差异的各类器官模型提供了前景广阔的研究手段。

方法

视网膜类器官的生成和培养

使用STEMdiff视网膜类器官试剂盒，从野生型（WT）人诱导多能干细胞（hiPSCs）中生成视网膜类器官。将hiPSCs接种于添加促进视网膜组织发育生长因子的培养基中，通过棋盘式刮除法生成类器官，并在150-200天的培养期内每2-3天更换培养基。在此期间，类器官逐渐形成明显的层状结构，包括外区、RPE细胞和神经节细胞中的光受体的形成。

视网膜细胞类型验证

通过目视观察重点关注视网膜特异结构的形态特征，例如外缘出现的相位亮层。采用免疫荧光染色技术验证视网膜细胞类型的存在，利用视杆细胞光感受器、双极细胞及神经节细胞的特异性标记物，确认各类视网膜细胞的分化状态。使用ImageXpress Micro共聚焦系统及MetaXpress高内涵成像采集与分析软件进行图像采集与分析，对免疫染色结果及细胞类型特异性标记物进行定量检测，确保样本间数据一致性。这种高通量分析方法使科研人员能够更精细地解析类器官的形态特征，并更准确地识别类器官内部分化的细胞类型。

钙成像和功能检测

通过记录光感受器层的钙离子峰值信号与振荡活动，评估视网膜类器官的钙离子功能活性，该指标可反映细胞对光刺激的响应情况。基于峰值计数、振幅及荧光强度变化等参数，对钙离子动力学特征进行分析。在成像前，使用Calcium 6染料试剂盒（Molecular Devices）将类器官置于50%培养基与50%钙离子染料的混合溶液中处理2小时，染料最终稀释浓度为5μM。为避免过早激活，类器官在孵育过程中全程保持避光条件。处理后，通过蓝光激发（405/20nm）诱导钙离子波动，随后采用自动化共聚焦成像系统进行钙成像，捕获钙离子活性的时序数据，精确量化钙离子通量动力学。该方法支持对基线状态与激发状态的高通量分析与比较，为深入解析类器官对光刺激的功能响应特性提供了技术支撑。

使用STEMdiff视网膜类器官试剂盒（Alpha测试版）生成人iPSC来源的视网膜类器官。培养至第150天时，视网膜类器官开始出现视杆细胞外段结构。实验采用培养约200天、具有丰富外段结构的成熟视网膜类器官。

结果

视网膜类器官重现了人类视网膜的关键特征，特别是光感受器层——该层由视杆细胞和视锥细胞构成，这些细胞形成有序的外段结构以检测光线。这些光感受器向顶端延伸，参与捕捉光线并启动视觉信号传导。然而，并非所有视网膜类器官都能形成明显的视网膜色素上皮（RPE）层，该层的存在具有可变性，尤其在更成熟的类器官中。尽管部分类器官缺乏明确的RPE层，其光感受器仍能表现出功能活性。

免疫荧光染色结果突显了视网膜类器官的层状结构，并鉴定了人类视网膜特有的关键细胞类型，如视杆细胞光感受器与双极细胞。这些结果表明类器官内视网膜细胞类型的发展与组织方式近似于人类视网膜结构。

图像采集完成后，我们使用MetaXpress软件在光感受器层内选择特定区域进行活性分析。通过测量时间与强度标准差的关系，量化光感受器响应的变异性。该数据可通过图表形式呈现，用于比较不同区域的活动差异，并揭示光感受器功能随时间的变化规律。

光遗传学实验

使用ImageXpress Micro共聚焦系统和MetaXpress软件进行光遗传学实验，首先通过DAPI蓝光激发（405/20nm）刺激视网膜类器官细胞，随后利用FITC通道（发射波长520/28nm）捕捉光感受器的反应，从而获取其激活状态的详细读数。该技术实现了在可控光照条件下对光感受器功能的精准监测。

数据采集设置

数据采集完成后，我们使用MetaXpress软件选取光感受器层内的特定区域进行活性分析。通过测量时间与光强标准差的关系，量化了光感受器反应的变异性。相关数据可绘制成图表，用于比较不同区域的活性差异，从而揭示光感受器功能随时间变化的动态特征。

类器官分析（激发态和基线活动）

类器官分析（无基线活动）

结论

我们开发了一种基于高内涵成像的方法，通过分析人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的视网膜类器官对蓝光刺激（405/20nm）产生的区域特异性钙离子振荡，来评估其光感受器功能。借助自动化共聚焦成像与高内涵检测分析技术，我们量化了不同类器官区域的强度波动并揭示了不对称活性。该方法能够检测野生型与疾病模型类器官之间的功能差异，为视网膜研究提供了可靠的高通量工具。我们的研究构建了一个重要技术框架，可用于探索疾病相关功能障碍并筛选潜在治疗策略，推动视网膜类器官作为人类视网膜生理与病理研究模型的发展。此外，该成像分析流程可拓展应用于其他类器官系统的非对称活性研究，为复杂组织模型研究提供更广泛的技术适用性。