酶标仪在细胞信号转导方向的应用
来自：junmin 更新日期：2025/11/21 点击量: 648
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细胞信号转导（Cell Signal Transduction）：是指细胞通过接受外界信号（如激素、神经递质、生长因子等），将这些信号通过一系列分子事件传递、放大并转换成特定的细胞反应的过程。这一过程涉及细胞表面受体的激活、信号分子的传递、信号的放大、以及最终效应器的激活，导致细胞增殖、分化、凋亡、代谢变化等一系列生物学效应。 细胞信号转导应用范围：疾病研究：许多疾病（如癌症、糖尿病、炎症性疾病）与细胞信号通路的异常有关，通过研究信号转导机制，能够更好地理解这些疾病的发病机制。 药物研发：许多药物通过调控信号转导通路发挥作用，例如激酶抑制剂、G 蛋白偶联受体（GPCR）激动剂或拮抗剂等。 基础研究：探索细胞如何响应环境变化，如应激反应、免疫应答等，信号转导是其中的关键环节。 研究细胞信号转导的必要性：揭示生物学机制：细胞信号转导是理解细胞功能和生物学过程的基础，通过研究信号通路，可以揭示细胞如何感知和响应外界信号。 疾病诊断和治疗：许多信号通路的异常与疾病直接相关，研究这些通路有助于发现新的疾病生物标志物，提供新的治疗靶点。 药物作用机制研究：药物往往通过影响特定的信号通路来发挥作用，了解这些通路有助于阐明药物的作用机制及其潜在副作用。 酶标仪在细胞信号转导研究中的应用：酶标仪（Microplate Reader），是一种用于检测酶联免疫吸附测定（ELISA）等实验中光吸收、荧光或化学发光信号的实验设备。它在细胞信号转导研究中具有广泛的应用，尤其是在评估细胞功能、信号通路活性、酶活性等方面。
酶活性检测：许多信号转导通路的关键节点是酶，如蛋白激酶和磷酸酶。酶标仪可以检测这些酶的活性变化，从而了解信号通路的激活状态。 基因表达分析：细胞信号转导常常导致特定基因的上调或下调，酶标仪可用于荧光定量PCR（qPCR）中，通过测量荧光强度来评估基因表达水平。 细胞增殖与毒性检测：通过检测细胞的代谢活性（例如MTT、CCK-8 试剂盒），酶标仪可以评估细胞增殖情况或检测药物的细胞毒性。 荧光与发光报告基因实验：通过报告基因系统（如荧光蛋白或萤火虫荧光素酶），可以在酶标仪上监测特定信号通路的活性。 离子通道及 G 蛋白偶联受体检测 酶标仪作为一种灵敏且多功能的检测工具，在细胞信号转导研究中有着广泛的应用。它能够帮助研究人员定量分析信号转导事件，并为细胞生物学、疾病机制、药物筛选等研究领域提供重要数据支持。研究细胞信号转导的必要性在于，它不仅能够帮助我们深入理解生命的基本过程，还能为临床医学和药物研发提供新的思路和方法。接下来主要介绍酶标仪在酶偶联受体、离子通道受体及 G 蛋白偶联受体方向的应用。
01. 酶标仪在酶偶联受体方向的应用 酶标仪的多功能性：现代酶标仪不仅仅用于传统的吸光度测定，还可以进行荧光、化学发光和时间分辨荧光等多种检测模式，这使得它们在酶偶联受体研究中具有广泛的应用潜力。 酶偶联受体的检测与分析：酶促反应检测：酶偶联受体通常涉及到酶促反应，这些反应可以通过酶标仪测量特定波长下的吸光度或荧光信号来量化。例如，通过测定底物的转化率来评估受体活性。 高通量筛选（HTS）：在药物开发中，酶标仪用于高通量筛选酶偶联受体的激动剂或拮抗剂。通过同时测量多个样品，可以快速筛选出具有活性的化合物。 动力学分析：酶标仪可以实时监测酶促反应的动力学，帮助研究者了解酶偶联受体的作用机制，如计算酶的Km和Vmax值，分析酶抑制剂的效力。 荧光共振能量转移（FRET）：在受体研究中，FRET是一种常见的技术。酶标仪可以用来测量FRET信号，从而研究酶偶联受体的二聚化、配体结合等生物学过程。
02. 酶标仪在离子通道受体及 G 蛋白偶联受体方向的应用
所谓信号转导，其实就是细胞外的信号（配体或电、机械等信号）作用在细胞的受体上，进而使细胞产生不同的生物学效应的过程。接下来主要介绍应用较多的在膜上的两大类受体：离子通道受体和 G 蛋白偶联受体。
1.离子通道受体：主要有两类：配体门控离子通道和电压敏感离子通道。配体门控离子通道的开放由神经递质调节，而电压门控离子通道则由其所在膜上的电荷调节。
配体门控离子通道
当神经递质与离子通道上的受体结合时，该神经递质会导致受体发生构象变化，从而打开离子通道。
配体门控离子通道既是一种受体，也是一种离子通道，因此也称为离子通道偶联受体或离子型受体。配体门控离子通道由几个长串氨基酸组成，这些氨基酸围绕离子通道组装成亚基。修饰在这些亚基上的还有神经递质、离子和药物的多种结合位点。也就是说，这些复杂蛋白质有几个位点，一些离子穿过通道，另一些离子也与通道结合。
电压敏感离子通道
事实上，神经传导、动作电位和神经递质释放的关键方面都是由另一类离子通道介导的，这些离子通道被称为电压敏感或电压门控离子通道，因为它们的打开和关闭是由它们所在的膜上的离子电荷或电压电位调节的。由膜两侧的电位差的变化决定通道开关。如当神经细胞膜去极化达到一定程度时，细胞膜上的钠离子通道就会开启，这个钠离子通道就是一种电压门控通道。怀疑几种精神类药物对电压敏感钠通道（VSSCs）和电压敏感钙通道（VSCCs）有效。
肿瘤中 PTEN 基因编码的蛋白具有脂质磷酸酶活性，能拮抗 PI3K 作用，使 PIP3 脱磷酸生成 PIP2，维持 PIP3 低水平，进而下调 PI3K /Akt 通路，加速细胞凋亡、抑制细胞生存。
PTEN 作用下生成 PIP2，不止仅仅可阻止 AKT 的作用。其次 PIP2 作为磷脂酶 Cβ(PLCβ) 的底物，产生 DAG 和 IP3 作为第二信使，升高胞内钙离子的水平并激活蛋白激酶 C(PKC)，膜结合的 PIP2 也能介导增加多种离子通道的活性，包括钙离子、钾离子和钠离子通道检测，搭配对应的检测试剂盒，适用于荧光显微镜、酶标仪和流式细胞仪。
GPCR 是免疫，肿瘤，代谢性疾病，神经和呼吸病等几乎所有疾病领域中的核心靶点。
其中靶向 Gq GPCRs 的激活会迅速诱发胞内钙流产生，在数秒之内提升胞浆钙离子浓度几倍甚至十倍。整个过程可以通过支持快速动力学模式的荧光酶标仪和特异的钙离子荧光染料进行追踪。来自于 Molecular Devices 的 FlexStation 3 台式钙流检测工作站自问世以来便以其 8 道或 16 道移液系统和毫秒级的采样间隔成为了 GPCR 药物筛选，钙流监测的平台。
钙离子荧光染料主要分为比例法和非比例法染料。比例法染料，如 Fura-2 QBT，在结合钙离子后其最佳激发/发射波长组合会发生偏移，从激发 380 nm/发射 510 nm变成激发 340 nm/发射 510 nm。随着结合钙离子浓度的提升，激发 340 nm/发射 510 nm的荧光值会逐渐上升，激发 380 nm/发射 510 nm的荧光值逐渐下降，因此追踪这两个荧光信号的比值就能分析细胞内钙离子浓度的变化(图4)。因为是检测荧光值的比值，因此比例法检测不易受染色效率和细胞密度等因素的影响。同时，近年来非比例法染料，如 Fluo 系列和 FLIPR Calcium 系列，因其高性噪比，非紫外的激发检测和检测简便等优势受到众多研究者的青睐。与比例法染料不同，非比例法染料结合钙离子后会直接提升其荧光信号值，无需进行双波长检测。
比例法染料检测示意图，绿线代表 340 nm激发/510 nm发射信号，黄线代表 380 nm激发/510 nm发射信号。蓝线代表绿线和黄线的信号比值，其随着钙离子浓度的上升而上升。材料来源于 Molecular Devices Fura-2 QBT 试剂盒相关文件。
应用分享之在 Flexstation 3 上应用 Fura-2, Am
检测血小板钙流：
胞内钙离子是血小板功能的核心调控者并在血栓疾病发生中扮演着关键的角色。然而，脆弱的血小板使钙离子浓度很难衡量。基于 FlexStation 3 酶标仪的方法可做到精确且快速的分析，获得激动剂 EC50 和拮抗剂 IC50 值，并在人原代组织的基础上支持中等通量新药物筛选和发现。
在微孔板体系中使用钙离子高亲和力荧光指示剂 Fura-2, AM（钙离子高亲和力荧光指示剂 ）进行简便，可行的原代人血小板钙流的检测。
总之，结合了快速动力学模式的酶标仪的出现无异于是一剂药物研发的强心针，变革了 GPCR 药物研发进程。在高亲和力钙离子探针和 G 蛋白嵌合体的帮助下，我们几乎可以对任一 GPCR 进行高通量药物筛选和分析，直接获得功能性的验证数据。同时针对靶向调控膜电位的 GPCR，我们也可以应用膜电位监测进行分析，获得钙流发现不到的靶标。
MD 酶标仪推荐—FlexStation 3：
多检测模式：FlexStation 3 支持吸光度、荧光、化学发光和FRET等多种检测模式，适用于多种酶偶联受体实验。 集成液体处理系统：该仪器配备了一个集成的液体处理系统，可以在实验过程中自动添加试剂、底物或抑制剂。这对于实时监测酶促反应和进行动力学研究非常有用。 高通量与灵活性：FlexStation 3 能够处理 96 孔和 384 孔板，适合高通量筛选，同时它还提供了较高的灵活性，可以适应不同的实验需求。 用户友好软件：该仪器配套的SoftMax Pro软件，提供了强大的数据分析功能，可以轻松进行复杂的动力学分析、数据导出和报告生成。 应用广泛：除了酶偶联受体研究，FlexStation 3还广泛应用于其他生物医学研究领域，如药物筛选、基因表达分析和细胞信号传导研究。 综上所述，FlexStation 3 酶标仪以其多功能性、高通量能力和用户友好的操作系统，特别适合在酶偶联受体研究中使用。它能够为研究者提供准确且高效的实验数据，是一款值得推荐的仪器。 |
